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人Ⅰ型前胶原(PCⅠ) ELISA
简介
在原胶原蛋白向胶原蛋白的细胞外转化过程中，原胶原蛋白前肽，即原胶原蛋白I型羧基端前肽（PICP）和原胶原蛋白I型氨基端前肽（PINP），被释放到循环中。I型胶原蛋白是由两条相同的α1（I）多肽链和一条α2（I）多肽链组成的三聚体，是骨基质的主要蛋白质（90%）。它是由成骨细胞合成的前体，并分泌到细胞外空间，在那里它经历了一系列翻译后的修饰，包括由特定的蛋白酶裂解的前肽。前肽被释放到循环中，新形成的胶原蛋白分子组装成纤维状。
本试剂盒人PCⅠ免疫测定是一种三步法固相夹心ELISA，用于测量细胞培养上清液、血清和血浆中的人PCⅠ。试剂盒包含大肠杆菌表达重组人PCⅠ和针对重组蛋白产生的抗体。使用天然人PCⅠ获得的结果显示出与使用重组标准品获得的标准曲线平行的线性曲线。这些结果表明，该试剂盒可用于测定天然人PCⅠ的相对质量值。
试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物PCⅠ，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中PCⅠ的浓度。
示例数据
以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。
标准品浓度(ng/mL) | 20 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0 |
OD值 | 2.609 | 1.793 | 1.062 | 0.629 | 0.469 | 0.295 | 0.182 | 0.07 |
校正OD值 | 2.539 | 1.723 | 0.992 | 0.559 | 0.399 | 0.225 | 0.112 | 0 |
本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果。
操作内精密度（测定中的精密度）在一块平板上对两个已知浓度的样品进行20次测试，以评估测定内精密性。
操作间精度（测定间精度）在10个单独的测定中测试两个已知浓度的样品，以评估测定间精度。至少有三名技术人员进行了实验。
操作内精密度 | 操作间精密度 | |||
样本 | 1 | 2 | 1 | 2 |
测定次数（n） | 20 | 20 | 10 | 10 |
平均值M（ng/mL） | 14.92 | 3.67 | 14.90 | 3.71 |
标准差SD | 1.31 | 0.18 | 1.24 | 0.21 |
变异系数CV（%） | 8.8% | 5.0% | 8.3% | 5.6% |
回收率
回收率在不同基质的整个测定范围内选取在健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入3个不同浓度水平计算回收率。
样本类型 | 范围（%） | 平均回收率（%） |
血清(n=8) | 86-102 | 94 |
血浆(n=8) | 90-106 | 98 |
细胞培养上清(n=8) | 94-110 | 102 |
灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.16ng/mL。
线性关系
分别在选取的4份健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入高浓度PCⅠ，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。
稀释比例 | 回收率（%） | 血清 | 血浆 | 细胞培养上清 |
1:2 | 范围（%） | 82-96 | 90-98 | 92-112 |
1:4 | 范围（%） | 88-104 | 89-107 | 104-116 |
1:8 | 范围（%） | 85-102 | 92-101 | 99-115 |
特异性
该试剂盒测定可识别天然和重组人PCⅠ。
其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。
