5min Fast TOPO Cloning Kit

产品概述

本产品为经优化的TOPO克隆试剂盒，产品使用了新型的Topoisomerase，添加二代平末端化因子和载体自连抑制，配合最适buffer，得本产品能够在5 min内快速完成TA克隆及平末端克隆。

核心技术原理

TOPO异构酶作用机制：载体两端通过磷酸键偶联TOPO酶，形成活性复合物。插入片段的5'端羟基攻击载体磷酸键，释放能量驱动连接，TOPO酶随后脱落，完成无缝连接。载体含ccdB致死基因，仅阳性克隆（插入片段破坏ccdB）能存活，实现“零背景”筛选。

对比传统克隆：传统方法依赖T4连接酶，需冰浴、热休克及1小时复苏，阳性率仅60-80%。TOPO克隆无需酶切、连接酶或复杂步骤，操作简化，效率提升至95%以上。

产品特点&优势：—阳性率高，可达95%以上；

保存条件：-30~-15 ℃保存，干冰/-20 ℃运输。

克隆转化

1)   用移液枪轻柔吹打混匀后离心至底部。

2) 20~37 ℃反应5 min(推荐使用25 ℃，5 min，PCR仪控温)。

3)   反应结束后，将离心管置于冰上。

4) 将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，如下:

【以化学感受态细胞DH5α转化方法为例。】

1、感受态细胞于-80℃冰箱取出后于冰上融化（注：感受态细胞融化后不可久置，不可反复冻融）；

2、取5 µl连接反应液加入至100 µl感受态细胞中，混匀，冰浴30 min；

(注：100 µl感受态细胞不要添加多于10 µl的反应液，反应液添加过多可能会降低转化效率)；

3、42℃水浴45 sec；

4、水浴后迅速置于冰上2 min；

5、加入900 µl LB或SOC培养基，37℃ 200 rpm培养1 h；

6、取100 µl菌培养液均匀涂布于带有抗性的LB固体培养基上，37℃恒温箱倒置培养~16 h；

7、阳性克隆筛选。

注意事项：

1、本制品每次使用时务必使用桌面离心机点离后用移液枪轻柔地吹打混匀，避免剧烈震荡，以免酶失活。

2、 反应体系需要在冰上配制，配制好的反应液需轻柔混匀离心后再放置于PCR 仪中反应。

3、 引物5'端不能磷酸化。